食品安全与动植物检疫是保障公众健康、维护生态安全的关键环节。近年来，食品市场中“牛肉掺马肉”“羊肉掺鸭肉”“名贵中药材以伪代真”等物种掺假问题频发，不仅损害消费者权益，还可能引发过敏、食源性疾病等风险；同时，外来物种入侵（如红火蚁、假高粱）及疫病载体物种（如携带禽流感病毒的野禽）的快速识别，也对检疫检测的时效性与准确性提出更高要求。

传统物种鉴定方法存在明显局限：形态学鉴定依赖专业经验，无法识别破碎、加工后的样本；普通PCR需电泳验证，操作繁琐且无法定量；进口荧光定量PCR仪则存在成本高、售后响应慢等问题。博清生物科技（南京）有限公司作为国产仪器代表，其研发的荧光定量PCR仪具有高性价比、适配国产试剂、操作便捷等特点。本研究通过建立标准化检测体系，系统验证该仪器在物种鉴定中的性能，为其推广应用提供科研依据。

一、材料与方法

（一）实验材料

1、样本来源：实验用牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉、三文鱼、鳕鱼、西洋参、人参等样本均采自当地农贸市场；检疫截留样本（疑似携带外来物种卵的木材、进口冻品）由当地海关提供。

2、试剂：动物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、2×TaqMan® Probe qPCR Mix、目标物种特异性引物与探针。

3、仪器：博清生物荧光定量PCR仪、超微量分光光度计、高速离心机。

（二）实验方法

1、样本前处理与DNA提取

肉类/水产品样本：取50mg组织，经液氮研磨后，用动物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，操作严格遵循试剂盒说明书。

中药材样本：取100mg粉末，用植物基因组DNA提取试剂盒去除多糖、多酚干扰，提取总DNA。

检疫样本：木材样本刮取表面粉末，冻品样本取100mg组织，按对应试剂盒提取DNA。

用超微量分光光度计检测DNA纯度（A260/A280值1.8~2.0为合格）与浓度，并用无酶水稀释至100ng/μL备用。

2、引物与探针设计

以物种保守基因序列为靶点，通过NCBI数据库比对，设计特异性引物与TaqMan探针，确保仅对目标物种产生荧光信号，无交叉反应。

3、qPCR反应体系与程序

反应体系（20μL）：2×TaqMan Probe qPCR Mix 10μL，上游引物（10μmol/L）0.8μL，下游引物（10μmol/L）0.8μL，探针（5μmol/L）0.4μL，DNA模板2μL，无酶水6μL。空白对照以无酶水替代模板，阴性对照以非目标物种DNA为模板。

反应程序：预变性95℃ 30s；扩增阶段40个循环（95℃ 5s，60℃ 30s，荧光信号采集于60℃阶段）；溶解曲线分析（60℃→95℃，升温速率0.1℃/s）。

4、仪器性能验证

特异性验证：以目标物种与非目标物种DNA为模板，检测荧光信号，判断是否存在交叉反应（Ct值＞38或无扩增为阴性）。

灵敏度验证：将目标物种标准质粒（浓度10⁶~10¹copies/μL）梯度稀释，检测最低检出浓度，分析Ct值与浓度的线性关系（R²≥0.99为合格）。

重复性验证：对同一标准品进行3次平行实验（批内重复），连续3天检测（批间重复），计算CV值（CV＜5%为合格）。

实际样本检测：对100份市场盲样（宣称“纯牛肉丸”“进口三文鱼”等）及50份检疫截留样本进行检测，与对照设备荧光定量PCR仪的结果比对，计算准确率。

二、结果与分析

（一）特异性结果

博清生物荧光定量PCR仪对目标物种（牛肉、三文鱼、西洋参）均产生明显荧光扩增曲线（Ct值22~28），非目标物种（猪肉、鳕鱼、人参）及空白对照均无扩增（Ct值＞38），特异性达100%。表明该仪器可通过特异性引物-探针体系，精准区分目标物种与干扰物种，避免假阳性。

（二）灵敏度结果

目标物种标准质粒浓度在10¹~10⁶copies/μL范围内，Ct值与浓度呈良好线性关系（R²=0.998~0.999），最低检测限为10¹copies/μL。该灵敏度可满足微量掺假检测需求（如牛肉中掺5%以下马肉）及检疫中低浓度样本（如昆虫卵、微量组织）的识别。

（三）重复性结果

批内重复实验中，各浓度标准品的CV值为0.8%~1.5%；批间重复实验中，CV值为1.2%~1.8%，均小于2%。表明博清生物仪器的检测稳定性优异，数据可靠性高，可满足实验室常规检测的重复性要求。

（四）实际样本检测结果

100份市场盲样中，博清生物仪器检出8份掺假样本（如“牛肉丸”掺猪肉、“西洋参”掺人参），与进口仪器检测结果完全一致，准确率100%；50份检疫截留样本中，检出3份携带外来物种（如木材中检出天牛卵DNA），准确率96%（2份因样本DNA降解导致假阴性，进口仪器同样未检出）。整体实际样本检测准确率达98%，且单轮反应耗时1.5小时，较传统PCR（3~4小时）效率提升50%以上。

三、讨论

本研究证实，博清生物荧光定量PCR仪在物种鉴定中具备“三高一快”优势：

（一）高特异性：基于保守基因的引物-探针设计，结合仪器精准的温度控制（温控精度±0.3℃），有效避免交叉反应，解决了“近缘物种难区分”的问题（如牛肉与马肉、西洋参与人参）。

（二）高灵敏度与重复性：最低检测限达10¹copies/μL，可检测微量掺假或低浓度检疫样本；CV值＜2% 的稳定性，确保不同批次、不同操作人员的检测数据一致，符合实验室质量控制要求。

（三）高效率：1.5小时完成单轮检测，且仪器支持96孔板同时运行，可满足批量样本筛查需求（如食品企业原料验收、海关集中检疫），较传统方法大幅缩短检测周期。

与进口仪器相比，博清生物仪器还具有明显的成本优势：仪器采购成本降低40%~50%，适配国产试剂（价格仅为进口试剂的1/3），且售后响应时间＜24小时，更适合基层实验室及中小企业推广应用。

本研究仍存在局限：目前仅验证了12种常见物种的检测体系，未来需扩展更多物种（如珍稀动物、外来入侵植物）的引物-探针库；针对高脂肪、高色素样本（如动物内脏、深色中药材）的DNA提取干扰，需进一步优化前处理方法。后续可结合多重qPCR技术，实现“一次反应检测多种物种”，进一步提升检测效率。

博清生物科技（南京）有限公司研发的荧光定量PCR仪在食品安全物种掺假检测与动植物检疫物种鉴定中，表现出高特异性、高灵敏度、高重复性与高效率的综合性能，且成本可控、操作便捷。该仪器可作为国产替代方案，广泛应用于食品生产企业、市场监管部门、海关检疫机构等场景，为保障食品安全与生态安全提供有力的技术支持。